As-tu un ordre précis pour arranger les fragments amplifiés?
En fait il existe des ligases pour coller des bords francs. Seulement l'arrangement sera aléatoire et il y a un fort risque de concaténation.
Je vois ce que tu as voulu faire, c'est un problème "théorique" qu'on apprend en cours, mais ça ne marche quasiement jamais. Lors de l'hybridation, le brin sens va avoir tendance à se réhybrider avec son brin antisens et non pas juste une séquence de 20 pb et le reste non hybridé (ce qui sera très instable). D'ailleurs, dans une PCR "normale", l'amorce vient se fixer entre les deux brins d'ADN, le reste de la séquence se réhybride entre sens et antisens.
Le seul moyen d'arranger les 3 fragments dans un ordre précis et sans concaténation est d'avoir des adaptateurs sur les amorces, faire 3 PCR distinctes avec un fragment et une paire d'amorce dans chaque, de digérer les produits PCR avec les enzymes de restrictions adéquates et de les liguer avec une T4 ligase. Et là il est bien trop tard, il aurait fallu y réfléchir bien AVANT.