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 Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

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vivelabm



Messages : 2
Date d'inscription : 17/03/2010

MessageSujet: Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR   Mer 17 Mar 2010 - 15:50

Bonjour,
Je souhaiterai obtenir un fragment d'ADN double brin à partir de 3 produits PCR.
J'ai 3 produits PCR : 1 de 450pb - 1 autre de 500pb et 1 dernier de 800pb.
J'aimerai obtenir un seul et même fragment à partir de ces 3 produits. Les coller ensemble si je puis dire...
J'ai déjà réalisé la technique par PCR : je mets comme matrice les 3 produits PCR à la même concentration et je réalise une première étape d'élongation avec le mix sans amorces (94°C 30s et 72°C 5mn) histoire que les 3 produits s'hybrident entre eux grâce à la Taq qui va élonger. Ensuite je rajoute les amorces et j'effectue une PCR classique. Pb je n'obtiens qu'un fragment à env 500pb et non pas 1750pb comme attendu. Embarassed
HELP !!!! Wink
PS : important 1 produit PCR a ses "bouts" en commun avec chacun des deux autres produits PCR (env 20pb) histoire qu'ils puissent s'hybrider...
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CIPION



Messages : 19
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Age : 75
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MessageSujet: Re: Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR   Mar 6 Avr 2010 - 17:36

Bonjour vivelabm
que signifient les ab......- PCR , pb, Taq . Je suis un profane en la matière, mais ça m'interrêsse.
cipion
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Karkaran
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Messages : 731
Date d'inscription : 17/01/2009

MessageSujet: Re: Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR   Mar 6 Avr 2010 - 20:56

les pb c'est pour paires de base, une PCR c'est une technique en biologie moléculaire qui permet d'amplifier la quantité d'ADN peu abondante don on dispose.
La Taq, c'est la Taq polymérase, une enzyme qui est utilisée lors des PCR.

Sinon, vivelabm, je ne suis pas spécialiste de la question donc je ne souhaite pas me prononcer, mais je peux demander à un ami qui l'est si vraiment tu as besoin d'une réponse.

Edit :
Je pense que ça ne marche pas parce qu'il faut une enzyme nécessaire pour "coller" les bouts entre eux : une ligase (je crois)...
La Taq permet juste l'élongation comme tu l'as justement remarqué, elle ne peut pas coller les brins entre eux... De plus, la Taq ne peut pas réellement marcher sans amorces (pour ta première étape).
Je pense que c'est à cause de ces petits problèmes que ça galère un peu!

Je pense qu'il faudrait faire une manip en mettant tes 3 brins dans un tube avec de la ligase afin de les lier et ensuite tu réalises une PCR normale avec amorces et Taq polymérase
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vivelabm



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MessageSujet: Re: Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR   Mer 7 Avr 2010 - 17:32

Karkaran,
je veux bien que tu soumettes, à ton ami expert en la matière, ma stratégie avec le dessin que j'ai mis en fichier attaché pour savoir ce qu'il en pense. merci
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Karkaran
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MessageSujet: Re: Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR   Jeu 8 Avr 2010 - 21:52

Sa réponse est dans mon précèdent message (la partie qui suit le mot "edit:").

Voilà, il a régulièrement fait des PCR depuis 2 ans, je pense qu'il a du voir juste.
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MessageSujet: Re: Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR   Ven 9 Avr 2010 - 22:26

As-tu un ordre précis pour arranger les fragments amplifiés?

En fait il existe des ligases pour coller des bords francs. Seulement l'arrangement sera aléatoire et il y a un fort risque de concaténation.

Je vois ce que tu as voulu faire, c'est un problème "théorique" qu'on apprend en cours, mais ça ne marche quasiement jamais. Lors de l'hybridation, le brin sens va avoir tendance à se réhybrider avec son brin antisens et non pas juste une séquence de 20 pb et le reste non hybridé (ce qui sera très instable). D'ailleurs, dans une PCR "normale", l'amorce vient se fixer entre les deux brins d'ADN, le reste de la séquence se réhybride entre sens et antisens.

Le seul moyen d'arranger les 3 fragments dans un ordre précis et sans concaténation est d'avoir des adaptateurs sur les amorces, faire 3 PCR distinctes avec un fragment et une paire d'amorce dans chaque, de digérer les produits PCR avec les enzymes de restrictions adéquates et de les liguer avec une T4 ligase. Et là il est bien trop tard, il aurait fallu y réfléchir bien AVANT.
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MessageSujet: Re: Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR   

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